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本制品将热启动BAPA3G DNA聚合酶、反应Buffer、dNTP染料等试剂预混在一起，是一种2×浓度的单组分预混试剂。该制品不含有ROX校正染料，适用于各种荧光标记探针，并且适用于各种定量PCR机型。优化的反应缓冲液，使得2×BAPA3G Probe qPCR Mix(含UDG)可用于单重及多重的探针法定量PCR。

本制品中的BAPA3G DNA聚合酶为第三代DNA聚合酶，其具有最高的杂质耐受性，其对乙醇、胍盐、肝素、血清、植物多糖多酚具有极高的耐受性，因此可用于粗样品的直接定量PCR检测。该酶经化学法修饰，在50℃以下100%无活性，只有95℃条件下加热5min后才能完全恢复酶的活力。因此2×BAPA3G Probe qPCR Mix(含UDG)可以有效抑制非特异性PCR扩增，极大的提高了PCR扩增特异性。

本制品中的BAPA3G DNA聚合酶对dUTP具有极强的识别能力，本制品中的dTTP核酸碱基完全被dUTP所取代，因此扩增产物均包含dUTP，配合热敏UDG酶能实现极佳的防污染能力。在10⁵ copies污染物的测试条件下，Ct推迟15个以上（污染去除能力>99.997%）。

• 极强的识别dUTP的能力，极好的防污染能力。
  
• BAPA3G DNA聚合酶强劲的扩增性能，可用于4重以上的qPCR扩增。
  
• 杂质高耐受性，使用各种gDNA和cDNA，具有最佳的扩增成功率。
  
• 高灵敏度，宽范围的动态检测（>7个数量级）。
  
• 反应效率在95～110%之间，高准确度和重现性。
  
• 扩增程序40min内完成，具有10s扩增1kb的快速能力。
  
• 在不同的富含AT和GC目标物上产生更高的荧光检测。

基因分型、RNA转录的cDNA、基因组DNA、病毒DNA等定量检测。

组分	100T	2500T
2×BAPA3G Probe qPCR Mix(含UDG)	1mL	25mL
说明书	1份	1份

保存：-20℃避光，有效期3年。

• 按照如下组分配制20μL PCR反应体系：
  

  成分	用量	终浓度
  2×BAPA3G Probe qPCR Mix(含UDG)	10μL	1×
  Primer F1 (20μM)	0.1～0.4μL	0.1～0.4μM
  Primer R1 (20μM)	0.1～0.4μL	0.1～0.4μM
  Probe1 (20μM)	0.1～0.4μL	0.1～0.4μM
  其它引物和探针	X μL
  DNA模板	0.5～2μL
  ddH2O	至20μL

  
  
• 进行Real-Time PCR反应，通常采用两步法，程序如下：
  

  步骤	循环数	温度	时间	说明
  Stage 1	1	25℃	2min	去污染
  Stage 2	1	95℃	5min	热启动
  Stage 3	40	95℃	5s	变性
  		60℃	30s	收集信号，退火/延伸

  • 消化污染步骤中的温度设置在25～37℃之间均可，无显著差异，但高于42℃会导致热敏UDG消化能力急剧下降。
    
  • 退火延伸温度可在55～65℃调整。
• 在多数情况下，采用两步法程序可获得理想的扩增效果，在无法达到预期理想效果的情况下，也可采用三步法PCR程序，程序如下：
  

  步骤	循环数	温度	时间	说明
  Stage 1	1	25℃	2min	去污染
  Stage 2	1	95℃	5min	热启动
  Stage 3	40	95℃	5s	变性
  		55℃	10s	退火
  		72℃	30s	收集信号，延伸

  • 消化污染步骤中的温度设置在25～37℃之间均可，无显著差异，但高于42℃会导致热敏UDG消化能力急剧下降。
• 反应结束后确认Real-Time PCR的扩增曲线和标准曲线。

图1.首先使用含dUTP的BAPA3G Probe qPCR Mix扩增三种基因产物（GAPDH，EHP，Covid-19 N Gene），然后以10⁵拷贝的含U产物作为模板，分别用BAPA3G Probe qPCR Mix(含UDG)和BAPA3G Probe qPCR Mix进行扩增，反应结束后统计两组之间的△Ct，结果为：这三个基因的△Ct值分别为15.3、17.1、16.2；△Ct值越大说明去除残留产物的效率越高，表明含UDG时具有良好的去除残留模板的能力。


图2.四重引物、探针检测。分别以nCoV S基因质粒（蓝线- FAM通道）、nCoV N基因质粒（绿线- VIC通道）、nCoV ORF1ab基因质粒（红线- Cy5通道）和人GAPDH内参Hela cDNA(黄线- ROX通道）为模板，四对引物和四条探针在同一体系内进行检测，模板均使用10e8～100copy/Test(7个数量级)，A为四重检测扩增曲线和标准曲线，C-E为单独每一个通道的性能展示，结果可见BAPA3G Probe qPCR Mix(含UDG)在7个数量级的动态检测中表现出卓越的扩增性能，各个通道之间区分良好。


BAPA3G DNA聚合酶对抑制物耐受性

杂质	耐受浓度		杂质	耐受浓度
SDS	0.01%		Serum	2%
EtOH	5%		Plasma Citrate	2%
Heparin	0.1IU/ml		Gua SCN	0.25%
Hematin	30μM		Trizol	0.5%

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